بررسی نحوه تولید و سم‌زدایی آفلاتركیسن

دسته: علوم پایه
بازدید: 90 بار
فرمت فایل: doc
حجم فایل: 53 کیلوبایت
تعداد صفحات فایل: 40

مقاله بررسی نحوه تولید و سم‌زدایی آفلاتركیسن در 40 صفحه ورد قابل ویرایش

قیمت فایل فقط 5,000 تومان

بررسی نحوه تولید و سم‌زدایی آفلاتركیسن در 40 صفحه ورد قابل ویرایش

مقدمه

آفلاتوكسین‌ها گروهی از مایكوتوكسین‌ها با قدرت سرطان‌زایی، جهش‌زایی و كاهش كارآیی سیستم ایمنی، می‌باشند (Eatan &Gallagher , 1294; IARC , 1993)  آنها از متابولیت‌های ثانویه سنتز شده توسط سویه های سم‌زای ASpergillus flavus , Aspergillus parasiticvs و Aspergillus nomius می‌باشند. آفلاتوكسین B₁ با توجه به پتانسیل بالاتری كه دارد، بیشتر مورد توجه قرار دارد. رشد قارچهای مولد سم وآلوده شدن به آفلاتوكسین در بسیاری از محصولات غذایی دیده می‌شود (Wood , 1989). در صورت مصرف غذاهای آلوده به سموم آفلاتوكسین B_1­ و B₂، این سموم به‌آفلاتوكسین‌های M₁ و M₂ متابولیزه می‌شوند و به درون بافت‌هاومایعات بیولوژیكی و شیر حیوانات شیرده ترشح می‌شوند (Zarba etal , 1992).

سویه‌های گونه‌های Bifidiobacterium , Lactobacillus , Lactococcus در تولید محصولات شیری تخمیری به عنوان استارتر كالچر و تولید كننده طعم و بو، به كار می‌روند نقش اصلی این كشت‌ها تولید اسیدهای آلی مثل اسیدلاكتیك در طی مراحل تخمیر است كه سبب افزایش عمر قفسه‌ای محصولات می‌شود و هم محتویات حساس آنها را تغییر می‌دهد.

اگر شیر به آفلاتوكسین‌ آلوده باشد، احتمال تخریب مرحله تخمیر و تولید تركیباتی با بوی تغییر یافته و ناخواسته را در محصول ایجاد می‌كند (Sutic & Banina , 1990).

اخیراً EL – Nezami  و همكارانش (1996 , 1998) گزارشاتی ارائه داده‌اند مبنی بر وجود سویه‌های خاص لاكتوباسیل‌ كه توانسته‌اند آفلاتوكسین‌ها را از محلول آبی جداكنند. به علاوه سویه‌های خاصی از باكتری‌های اسید لاكتیك، توانسته‌اند آفلاتوكسین M₁ را از شیر آلوده هم جداكنند (Pierides etal . ;2000). جداسازی آفلاتوكسین در نتیجه اتصال فیزیكی سم به دیواره سلولی یا تركیبات دیواره سلولی است    (Haskard et al. 2000 ; EL- Nezami et al. 1998 b).

همچنین جداسازی بعضی متابولیت‌های ضدقارچی مثل دی‌پپتیهدهای حلقوی و فنیل‌لاكتیك اسید و اسیدهای چرب هیدوركسیله شده از باكتری‌های اسیدلاكتیك، توانایی این گونه‌ها در بازدارندگی رشد قارچ‌های فاسد كننده مواد غذایی و مواد سم‌آفلاتوكسین را نشان می‌دهد.

آفلاتوكسین در ذرت

متابولیتهای سمی تولید شده توسط قارچها، كه به عنوان مایكوتوكسین شناخته می‌شوند، در طی چند سال اخیر بسیار مورد توجه واقع شده‌اند. مایكوتوكسین‌ها امروزه به عنوان تهدید كننده‌های سلامتی در حیوانات شناخته شده‌اند كه بیماری‌هایی مثل equine leukoencephalo malaci  در اسب‌ها و Porcine edema را در خوك‌ها ایجاد می‌كنند. كاهش وزن، كاهش باروری و كاهش مقاومت در برابر بیماریها و حتی مرگ را به مایكوتوكسین نسبت داده‌اند. هیچ حیوانی نسبت به آنها مقاوم نیست ولی به طور كلی حیوانات پیرتر مقاوم‌تر از حیوانات جوان هستند. بعضی مایكوتوكسین‌ها، مثل آفلاتوكسین در سلامتی‌اشان هم مخاطراتی را ایجاد می‌كنند. این مایكوتوكسین به عنوان یك موتاژن شناخته شده است. شناسایی آفلاتوكسین در ذرت می‌تواند باعث كاهش قیمت آن جهت بذر و یا حتی معدوم ساختن آن شود. آلودگی با مایكوتوكسین ها ارتباط مستقیم با تاثیرات جوی دارد.

قارچ Aspergillus Flavus تولید كننده آفلاتوكسین در محصولاتی مثل ذرت، پنبه‌دانه و بادام زمینی است. قارچ به طور معمول در طبیعت وجود دارد، اما مقدار آن در هوای گرم و خشك افزایش می‌یابد. آلودگی آفلاتوكسین در ذرت‌هایی بیشتر است كه تحت شرایط استرس تولید شده‌اند. بنابراین، خشكی، گرما، حشرات، كرم‌ها و استرس‌ ناشی از باروركنندگی همگی منجر به ایجاد مقادیر بالای آفلاتوكسین در گیاه می‌شوند. تلاش برای ایجاد هیبریدهای ذرتی كه به آلودگی قارچی مقاوم باشند و سم را در خود انباشته نكنند، وجود دارد، با وجود این هیبریدها بسیار مقاوم هستند ولی از تجمع سم به طور كلی نمی توان جلوگیری كرد. با كاهش استرس و مراقبت از حمله حشرات می‌توان در مقدار آفلاتوكسین كاهش ایجاد كرد (CAST , 1999) .

دمای Fْ100-80 و رطوبت نسبی %85 (% 20-18 رطوبت در دانه‌ها وجود دارد) شرایطی بهینه برای تولید سم و رشد قارچ است.

از طرف دیگر مصرف‌ این محصولات به عنوان خوراك دام می‌تواند سبب ایجاد انواع دیگری از آفلاتوكسین‌ها (M₁ , M­₂) در شیر حیوانات شود. آلودگی ذرت به عنوان غذای دام و طیور و نیز ماده اولیه جهت فراهم كردن انواع گسترده‌ای از مواد غذایی و تنقلات، دارای اهمیت ویژه‌ای است و كاهش آفلاتوكسین به روشهای مختلف ضروری می‌باشد.

محصولات كشاورزی مثل ذرت، علوفه، بنشن، گندم و یونجه را می‌توان با سیلوكردن نگاهداری كرد. در بسیاری از كشورها محصولات سیلویی دارای ارزش غذایی بالاتری به خصوص برای دام‌ها می‌باشند. در كشورهای اروپایی مثل هلند، آلمان و دانمارك بیش از %90 محصولات تولیدی در سیلوها نگاهداری می‌شوند. حتی در كشورهایی با شرایط عمومی آب وهوایی مناسب جهت خشك كردن مثل فرانسه و ایتالیا، حدود %50 از محصولات خود را در سیلوها نگاهداری می كنند. (wilkson et al.1996) . جهت تولید سیلویی با كیفیت بالا نیاز به مراحل تخمیر میكروبی مناسب وجود دارد. میكروارگانیسم‌های دخیل در مراحل تخمیر سیلوها، علاوه بر افزایش كیفیت غذایی محصول، قادر خواهند بود تا از رشد میكروارگانیسم‌های بیماری‌زا و همچنین قارچ‌های مولد توكسین، جلوگیری كنند.

از آنجاییكه سیلوكردن محصولات بر پایه تخمیرهای متنوع اسید لاكتیكی تحت شرایط بی‌هوازی است، به كار بردن سویه‌های باكتریایی تولیدكننده اسیدلاكتیك كه در سم‌زدایی و كاهش تولید آفلاتوكسین مؤثر هستند، منطقی‌تر به نظر می‌رسد. باكتری‌های اسیدلاكتیك محیطی و ساپروفیت موجود در محصولات، كربوهیدارتهای محلول در آب (WSC) موجود در محصولات را به اسیدلاكتیك و نیز مقدار كمی اسیداستیك تخمیر می‌كنند. بر اثر تولید این اسیدها، PH مواد سیلو شده پایین آمده و رشد میكروارگانیسم‌های فاسدكننده، باز داشته می‌شود. باكتری‌های اسیدلاكتیكی كه عمدتاً در سیلوها یافت می‌شوند. اعضای جنسی‌های لاكتوبا سیلوس، پدیوكوكوس، لوكونوستوك، انتروكوكوس، لاكتوكوكوس و استرپتوكوكوس می‌باشند. اكثر باكتری‌های اسیدلاكتیك موجود در سیلوها، مزوفیل‌اند، یعنی در دمای بین Cْ50-5 رشد می‌كنند كه دمای بهینه رشد آنها بین Cْ40-25 می‌باشد. آنها PH سیلو را تا 5-4 پایین می‌آورند كه این به گونه و شرایط محصول بستگی دارد.

همه باكتری‌های اسیدلاكتیكی هوازی های اختیاری‌ اند اما بعضی شرایط بی‌هوازی را ترجیح می‌دهند (Holzapfel and schillinger , 1992; Teuber et al. 1992) . جمعیت LAB در فاصله بین دروكردن و سیلو كردن محصول افزایش می‌یابد، كه این بر اثر احیاء حالت‌های تاخیری است و نه اضافه كردن مصنوعی و تلقیح میكروارگانیسم. محتوای قندی و تركیبات قندی موجود در محصول و مقدار ماده خشك و شرایط اسیدی و اسمزی موجود در سیلو، بر رشد و رقابت باكتری‌های اسید لاكتیك در تخمیر سیلویی تأثیر می‌گذارند. فاز تخمیری سیلوها در زمانیكه شرایط سیلو بی‌هوازی شود، آغاز می شود كه این عمل معمولاً بعد از چند ساعت از سیلوكردن كه اكسیژن اتمسفری موجود در اعضای گیاه و فواصل محصول خارج شد، آغاز می‌شود و بسته به نوع محصول سیلو شده و شرایط سیلو، برای چند روز تا چند هفته ادامه پیدا می‌كند. در این فاز، لاكتو باسیل‌ها میكروارگانیسم‌های غالب سیلو هستند و PH سیلو را با توجه به عمل تخمیر خود بین 5-8/3 پایین می‌آورند.

در فاز سوم كه فاز ثابت می‌باشد كه در صورت عدم دخول هوا به داخل سیلو، در بعضی مواقع به وجود می‌آید. در این حالت اكثر میكروارگانیسم‌های فاز تخمیری كاهش پیدا می‌كنند و تنها بعضی باكتری‌های مقاوم به اسید كه قادر به تولید پروتئازها و كربوهیدراتازهای مقاوم به اسید هستند، مثل lactobacillus buchneri در مقادیر كم قادر به رشد خواهند بود.

در فاز چهارم كه به محض قرار گرفتن سیلو در برابر هوا آغاز می‌شود، اسید آلی نگاهدارنده تولید شده توسط مخمرها و گاهی نیز باكتری‌های اسید استیك تخریب می‌شوند و درنتیجه PH بالا می‌رود و در مرحله بعد میكروارگانیسم‌های فاسد كننده شروع به فعالیت می‌كنند و قارچ‌های تولیدكننده توكسین‌ مثل آسپرژیلوس فلاووس در این مرحله شروع به رشد و تولید سم می‌كنند (Nout et al, 1993) .

به نظر می‌رسد كه نگاهداری سیلو در فازهای 2 و 3 با استفاده از افزودنیها و كاهش اكسیژن در هنگام سیلوكردن محصول، باعث جلوگیری از فساد قارچی و تولید سم خواهد شد.(Ste Fanie J. W. H. Oude Elferin Ketae. 2000) .

خصوصیات بیولوژیكی و مورفولوژیكی Aspergillus Flavus

آسپرژیلوس فلاووس متعلق به جنس آسپرژیلوس است كه دومین گونه متداول بعد از آسپرژیلوس فومیگاتوس می‌باشد. كلنی‌های A. flavus  سریع رشد می‌كنند و قطر كلنی آنها به cm 7-6 در 14-10 روز می‌رسد. رنگ كلنی در ابتدا زرد است و سپس به زرد متمایل به سبز یا سبز زیتونی تبدیل می‌شود. كلنی‌های قدیمی سبز تیره می‌شوند. شكل كلنی‌ها صاف است و بعضی دارای چروك‌های شعاعی‌اند. پشت كلنی بدون رنگ و یا به رنگ كرم است. محیط افتراقی، A. flavus , parasiticus آگار (AFPB)  است كه برای غربالگری و شناسایی گونه‌های A. flavus  طراحی شده است. I- Pitt , A.D.Hocking , 1985; H.Govrama , L.B.Bullerman ,1995 A.parasiticus , A. Flavas  در این محیط با تولید اسپورهای تیپیك زرد تا سبز زیتونی و پشت كلنی نارنجی روشن، متمایز می‌شوند. (K. B. Raper, (D.I.Fennell,1965) . جزئیات بیشتر را می توان زیر میكروسكوپ الكترونی اسكنینك (SEM) دید: كنیدیوسپورها بلند هستند ( 800 -400) و اغلب ظاهری سخت درست در كنار وزیكول‌های كروی دارد (253-24). فیلایدها به شكل پیرامونی بلند شده‌اند و در دو ردیف قرار دارند و بعضی اوقات تك ردیفی هستند؛ شكل سرهای كنیدیال از ستونی تا شعاعی و كروی متغیر است؛ طرز قرارگیری فیلایدها بر روی وزیكول شكل سركنیدیال را تعیین می‌كند. قطر آنها بین 65 -10 متغیر است (J.I.PiH & A.D.Hocking 1985) كنیدی‌ها از جدایی‌های A. flavus صاف تا كمی خشن هستند، در حالیكه كنیدی‌ها از A. Parasiticus  خشن هستند. گونه‌های خاصی تولید اسكلروتیای قهوه‌ای می‌كنند.

گونه‌های آسپرژیلوس فلاووس در خاك وجود دارند و طیف وسیعی از محصولات كشاورزی را در مزرعه‌ محل‌های نگهداری و نیز در طی فرآوری‌ و توزیع آلوده می‌كنند. Aspergillus Flavus زیرگونه A. bombycis , A.tamarii, A. nomius, Parasiticus  تنها قارچهایی هستند كه تولید آفلاتوكسین در آنها نشان داده شده است (C. P.Kurtmon, 1987 S. W. peterson, Y.Ito, B.W.Horn, T.Go to 2001; C.W.Hesseltin, B.W.Horn ).

سویه های آسپرژیلوس فلاووس دارای انواع غیرسم‌زا و تولید كننده‌های آفلاتوكسین (B₁ , B₂, ) می‌باشد كه در این بین A. Flavus   زیرگونه پارازیتیكوس، آفلاتوكسین‌های B₁, B₂, G₁, G­₂. (AFG₂, AFG₁,AFB_1, AFB₂ ) را تولید می‌كند و جدایی‌های غیرسم‌زایی كه آفلاتوكسین تولید نمی‌كنند در طبیعت نادر است (Du sanee Thanaboripat, Yang Qian, Lliu Ruigian, 2001)

تولید آفلاتوكسین

تخمین غلظت باكتریایی.

جهت تعیین مقدار مشخصی از باكتری مورد نظر، ازمقایسه نمونه ها با شاهد مك فارلند استفاده كردیم. برای به دست آوردن تعداد تقریبی 10⁹*9 باكتری درهر میلی لیتر، درهرلوله 3ml ازمحیط كشت مایع MRS را ریختیم تا كدورتی مشابه كدورت مك فارلند 10 پیدا كند(جذب نمونه ها در 600nm خوانده شده) بعد از تطبیق OD نمونه ها با شاهد مك فارلند، نمونه ها سانتریفوژ شده ، محیط كشت MRS دورریخته شد و حدود 3ml محلول فسفات با فرسالین (PBS) با  PH 7/23  ریخته شد و بعد از یكنواخت كردن سوسپانسیون باكتری در PBS مجدداً عمل سانتریفوژ (به مدت 12min بادور 2500-3000 rpm) صورت گرفت و مایع رویی دورریخته شد. این مرحله رادوبار تكرار كردیم و بدین ترتیب هیچ محیط كشتی درسوسپانسیون باكتریایی باقی نماند و رسوب باكتریایی كه درانتها به دست آمد را برای اضافه كردن محلول آفلاتوكسین كنار میگذاریم (k.peltonen,w.El.nezami,2001).

تعیین منحنی رشد باكتری

دراین مرحله به دلیل مقایسه جذب آفلاتوكسین توسط لاكتوباسیلوس درفازهای رشد و سكون و مرگ، منحنی رشد باكتری را تعیین كردیم. بدین منظور،  ازسوسپانسیون باكتریایی را به محیط كشت MRS مایع تلقیح كردیم و درفواصل زمانی 2h مقدارOO را درطول موج 600 nm خواندیم . درنهایت منحنی رشد باكتری را براساس مقدار جذب به زمان رسم كردیم و مراحل فاز رشد و سكون تعیین شد.

برای بررسی مقدار كاهش آفلاتوكسین درحالت مرگ باكتری، سوسپانسیون باكتری مقایسه شده با 10 مك فارلند را اتوكلاو كردیم، تا باكتری ها كاملاً ازبین بروند، سپس سانتریوفوژ كرده و به رسوب باكتریایی محلول آفلاتوكسین اضافه كردیم.

همچنین جهت بررسی میزان رشد یا عدم رشد سویه باكتری بهینه درمحلول آفلاتوكسین مورد آزمایش و نیز PBS به تنهایی، درطول مدت 120h مقدار جذب محلول رادرطول موج 600 nm خواندیم و روند رشد باكتری رادراین محلول ها بررسی كردیم.

تعیین میزان كاهش آفلاتوكسین

(Sigma,st.louis,Mo.)AFB₁ درمتانول حل شد و غلظت آن را با خواندن جذب آن به وسیله اسپكتروفوتومتری (unicam 5625 uv/vis) درطول موج 365 nm (4 = 21500 M^-1cm^-1) و نیز معادله lamber-beer به دست آوردیم وبرای تهیه 25ml محلول آفلاتوكسین 5ppm، 11/3 ml ازمحلول را در evaporator  گذاشتیم و متانول آن را تبخیر كردیم و سپس به وسیله PBS به حجم رساندیم و بدین ترتیب، محلول آفلاتوكسین باغلظت (gr/ml)  5ppmبه دست آوردیم. از این محلول 5ppm ، محلولهای دیگری با غلظت های 1000ppb (ngr/ml)و500و400و200و100و50 جهت مقایسه اثر كاهش درغلظتهای مختلف ونیز كالبراسیون دستگاه HPLC تهیه كردیم.

؟

به رسوبات باكتری تهیه شده درمرحله قبل، 1/5 ml ازمحلول آفلاتوكسppm)B₁ 5/0)اضافه كردیم و درمدت زمانهای مختلف دردمای ^Cْ37 گرماگذاری كردیم. برای هر سویه باكتریایی، یك شاهد باكتریایی (باكتری تلقیح شده در PBS) و یك شاهد AFB₁  (5/0 آفلاتوكسین B₁  در PBS) گذاشتیم (k.peltanen,H.EL.Nezamie,2001)

درهر مرحله زمانی، جهت بررسی مقدار AFB₁ كاهش نیافته، بعد از سانتریوفوژ كردن محلول ها و رسوب دادن باكتریها 100 ,(2500-3000 rpm,12min) از فاز مایع راجهت بررسی برمی داریم. زمان گرماگذاری تا 90 h ادامه یافت و درمقاطع زمانی 1,24,48,90 h  ازمایع رویی محلول باكتری و AFB₁ برداشت شد. كلیه بررسی‌ها سه تكرار داشتند.

اثر شستشو بربازگشت آفلاتوكسین كاهش یافته

بعد از اتمام دوره گرماگذاری و برداشتن 100 مایع رویی محلول درمقاطع زمانی مختلف، درانتهای 90h، مایع رویی دور ریخته شده و رسوب باكتریایی به وسیله 2ml محلول PBS شسته می شود. بدین صورت كه بعد از اضافه كردن PBS و یكنواخت كردن سوسپانسیون، آن را به مدت 10min دردمای ^Cْ37 گرماگذاری كردیم و سپس مجدداً سوسپانسیون را سانتریوفوژ كردیم و 100 ازمایع رویی را برای سنجش میزان آفلاتوكسین آزاد شده بررسی كردیم. این عمل را سه بار تكرار كردیم و بعد از هر بار شستشو مقدار آفلاتوكسین آزاد شده را بررسی كردیم.

(Carolyn A.Haskard et al,2001;K.Peltonen,W.EI.Nezami,2001)

تعیین مقدار AEB₁ باقی مانده درمایع رویی نمونه ها

مایع رویی نمونه ها به وسیله دستگاه HPLC برای تعیین میزان AFB₁ كاهش یافته توسط باكتری مورد نظر با استفاده از این فرمول محاسبه شد(K.Peltonen et al,2001)

؟

ازاین شاهد AFB₁  برای تعیین میزان AFB₁ آزاد شده پس از شستشو هم استفاده شد.

HPLC

جهت تعیین میزان آفلاتوكسین از روش HPLC فاز معكوس بدون روش استخراج، استفاده شد (EL-Nezami et al,1998a). سیستم HPL3 (Cat No.CTS-03525) (Serial.No.880-06, Lot.No.26/275 شامل یك سیستم انتقال دهنده فاز سیال دو پمپی ، دتكتور UV و یك ستون ODS spheri-5 C18 با ابعاد 2504/6mm بود. حجم نمونه تزریقی معادل 70 بودوفاز سیال عبارت بود از :آب مقطر/متانول/استونیتریل   ;vol/vol/vol) 58/21/21)كه دارای Flow rate یاسرعت جریان 1/25ml/min بود. طول موج دتكتور UV برروی 365nm تنظیم شده بود.

ابتدا به وسیله هفت محلول استاندارد آفلاتوكسین B₁ تهیه شده درمراحل قبل ، منحنی كالیبراسیون دستگاه تهیه شد .

(Kalantri, H, zandamoghadam A,Ahvaz-Iran;A.manda,B.P.Naidu,Nageswara Rao C.2004)

سویه های قارچی و شرایط كشت

جدایی آسپرژیلوس فلاووس توكسین‌زا (MAS 915 ;473.5 ppb) ازموسسه دفع آفات و بیماریهای گیاهی، بخش مایكوتوكسین، تهیه شد. یك كشت Slant ازآن تهیه شد(برروی Potato Dextrose Agav,PDA) به مدت یك هفته دردمای ^Cْ30 نگهداری شد. برای شمارش تعداد اسپورها، PBS 5ml به درون لوله ریخته شد و بعد ازشستشوی كامل، سوسپانسیون حاوی اسپورهای قارچی به لوله استریلی كه حاوی  50 توئین 80 استریل شده بود، انتقال داده شد. سپس  50 از سوسپانسیون حاصل را برروی لام نئو بارگذاشتیم و تعداد اسپورها راشمارش كردیم. كل تعداد اسپورها را به 400تقسیم كردیم تا دراین صورت مقدار اسپور موجود درهر مربع كوچك را بیابیم، سپس از آنجاییكه این تعداد درحجم 1/4000,000ml هر مربع می باشد باید رقم حاصل رادر 4000,000 ضرب بكنیم و بدین گونه، تعداد اسپورها را هرمیلی لیتر محاسبه كردیم. جهت تهیه 10³ و  10⁶اسپور، رقتهای متوالی تهیه كردیم، تا به تعداد مورد نظر برسیم.

(jesper magnusson, Johan schnurer, 2000, katrin strom, Jorgen sjogren, 2002)

قیمت فایل فقط 5,000 تومان

برچسب ها : تحقیق بررسی نحوه تولید و سم‌زدایی آفلاتركیسن , پروژه بررسی نحوه تولید و سم‌زدایی آفلاتركیسن , مقاله بررسی نحوه تولید و سم‌زدایی آفلاتركیسن , دانلود تحقیق بررسی نحوه تولید و سم‌زدایی آفلاتركیسن , بررسی نحوه تولید و سم‌زدایی آفلاتركیسن , نحوه تولید , سم‌زدایی , آفلاتركیسن